فاسٹ کنگ ون سٹیپ RT-PCR کٹ۔

A-1 RNA تنزلی کا شکار ہے۔

high بغیر کسی آلودگی کے اعلی معیار کا آر این اے صاف کریں۔ آر این اے کی تنزلی کو روکنے کے لیے جس مواد سے آر این اے نکالا جاتا ہے وہ زیادہ سے زیادہ تازہ ہونا چاہیے۔ RT رد عمل سے پہلے بدنام شدہ جیل پر RNA سالمیت کا تجزیہ کریں۔ آر این اے نکالنے کے بعد ، اسے 100 for فارمامائڈ میں محفوظ کیا جانا چاہئے۔ اگر RNase روکنے والا استعمال کیا جاتا ہے تو ، حرارتی درجہ حرارت <45 ° C ، اور pH 8.0 سے کم ہونا چاہئے ، ورنہ روکنے والا تمام پابند RNase کو جاری کرے گا۔ مزید یہ کہ ، RNase روکنے والے کو solutions 0.8 ملی میٹر DTT پر مشتمل حل میں شامل کیا جانا چاہئے۔

A-2 RNA ریورس ٹرانسکرپشن رد عمل کو روکتا ہے۔

ریورس ٹرانسکرپشن روکنے والوں میں ایس ڈی ایس ، ای ڈی ٹی اے ، گلیسرول ، سوڈیم پائروفاسفیٹ ، سپرمیڈائن ، فارامائڈ ، گوانائڈائن نمک وغیرہ شامل ہیں ، کنٹرول آر این اے کو نمونے کے ساتھ ملائیں ، اور کنٹرول آر این اے کے رد عمل سے پیداوار کا موازنہ کریں تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ کوئی روکنے والا ہے یا نہیں۔ روکنے والوں کو ہٹانے کے لیے 70 فیصد (v/v) ایتھنول سے آر این اے کی بارش کو دھوئے۔

A-3 پرائمر کی ناکافی اینیلنگ جو سی ڈی این اے کے پہلے کنارے کی ترکیب کے لیے استعمال ہوتی ہے۔

اس بات کا تعین کریں کہ اینیلنگ درجہ حرارت تجربے میں استعمال ہونے والے پرائمر کے لیے موزوں ہے۔ بے ترتیب ہیکسامرز کے لیے ، یہ سفارش کی جاتی ہے کہ رد عمل کے درجہ حرارت تک پہنچنے سے پہلے درجہ حرارت کو 25 ° C پر 10 منٹ تک رکھیں۔ جین سے متعلق پرائمر (جی ایس پی) کے لیے ، دیگر جی ایس پی آزمائیں ، یا اولیگو (ڈی ٹی) یا بے ترتیب ہیکسامر پر جائیں۔

A-4 RNA شروع کرنے کی چھوٹی مقدار۔

RNA کی مقدار میں اضافہ کریں۔ 50 این جی سے کم آر این اے کے نمونوں کے لیے ، 0.1 μg سے 0.5 μg acetyl BSA پہلے اسٹرینڈ سی ڈی این اے ترکیب میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔

A-5 تجزیہ شدہ ٹشوز میں ہدف کی ترتیب کا اظہار نہیں کیا جاتا ہے۔

دوسرے ٹشوز کو آزمائیں۔

A-6 PCR رد عمل ناکام

دو قدم RT-PCR کے لیے ، پی سی آر مرحلے میں سی ڈی این اے ٹیمپلیٹ رد عمل کے حجم کے 1/5 سے زیادہ نہیں ہو سکتا۔

A-1 پرائمر اور ٹیمپلیٹس کی غیر مخصوص اینیلنگ۔

پرائمر کے 3'-اینڈ میں 2-3 ڈی جی یا ڈی سی نہیں ہونا چاہیے۔ بے ترتیب پرائمر یا اولیگو (ڈی ٹی) کے بجائے پہلے سٹرینڈ ترکیب میں جین کے مخصوص پرائمر استعمال کریں۔ پہلے چند چکروں میں اینیلنگ کا زیادہ درجہ حرارت ، اور پھر اینیلنگ کا کم درجہ حرارت استعمال کریں۔ پی سی آر کے لیے ہاٹ اسٹارٹ طاق ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کریں تاکہ رد عمل کی خاصیت کو بہتر بنایا جاسکے۔

A-2 جین مخصوص پرائمر کا ناقص ڈیزائن۔

l پرائمر ڈیزائن کو بڑھانے کے لیے انہی اصولوں پر عمل کریں۔

A-3 RNA جینومک DNA سے آلودہ۔

پی سی آر گریڈ DNase I کے ساتھ RNA کا علاج کریں۔

A-4 پرائمر ڈائمر کی تشکیل

pri 3 'کے اختتام پر تکمیلی ترتیب کے بغیر پرائمر ڈیزائن کریں۔

A-5 بہت زیادہ Mg^2+۔ توجہ مرکوز کرنا

pt Optimize Mg^2+۔ ہر سانچے اور پرائمر مجموعہ کے لیے حراستی۔

A-6 غیر ملکی ڈی این اے سے آلودہ۔

یروزول مزاحم تجاویز اور UDG انزائم استعمال کریں۔

A-1 پہلی اسٹرینڈ پروڈکٹ کا مواد بہت زیادہ ہے۔

PC روایتی پی سی آر رد عمل کے مرحلے میں پہلے اسٹرینڈ پروڈکٹ کی مقدار کم کریں۔

پی سی آر رد عمل میں A-2 بہت زیادہ پرائمر رقم۔

پرائمر ان پٹ کو کم کریں۔

A-3 بہت زیادہ سائیکل۔

پی سی آر رد عمل کے حالات کو بہتر بنائیں اور پی سی آر سائیکل نمبر کو کم کریں۔

A-4 بہت کم اینیلنگ درجہ حرارت۔

غیر مخصوص آغاز اور توسیع کو روکنے کے لیے اینیلنگ درجہ حرارت میں اضافہ کریں۔

A-5 اولیگونوکلیوٹائڈ کے ٹکڑوں کا غیر مخصوص اضافہ جو ڈی این اے کے ڈی این اے ہراس سے پیدا ہوتا ہے-ڈی این اے آلودگی کو روکنے کے لیے اعلیٰ معیار کے آر این اے نکالیں۔

RT-PCR کو RNA کو سی ڈی این اے میں تبدیل کرنا ہے ، اور پھر ریورس ٹرانسکرپٹ سی ڈی این اے کو ہدف کے ٹکڑے کو بڑھانے کے لیے پی سی آر رد عمل کے سانچے کے طور پر استعمال کرنا ہے۔ تجربے کی مخصوص شرائط کے مطابق یا تو بے ترتیب پرائمر ، اولیگو ڈی ٹی اور جین مخصوص پرائمر منتخب کریں۔ مذکورہ بالا تمام پرائمر مختصر یوکریاٹک سیل ایم آر این اے کے بغیر ہیئر پن کی ساخت کے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔

رینڈم پرائمر: بالوں کے ڈھانچے کے ساتھ لمبے آر این اے کے لیے موزوں ہے ، نیز ہر قسم کے آر این اے جیسے آر آر این اے ، ایم آر این اے ، ٹی آر این اے ، وغیرہ وہ بنیادی طور پر ایک سانچے کے آر ٹی پی سی آر رد عمل کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔

اولیگو ڈی ٹی: پولی اے ٹیلنگ والے آر این اے کے لیے موزوں چونکہ اولیگو ڈی ٹی پولی اے ٹیل کا پابند ہے ، لہذا آر این اے نمونوں کا معیار زیادہ ہونا ضروری ہے ، اور یہاں تک کہ تھوڑی سی کمی بھی پوری لمبائی والے سی ڈی این اے ترکیب کی مقدار کو بہت کم کردے گی۔

جین سے متعلقہ پرائمر: ٹیمپلیٹ تسلسل کا تکمیلی ، ان حالات کے لیے موزوں جہاں ہدف ترتیب کو جانا جاتا ہے۔

دو طریقے ہیں:

1. اندرونی حوالہ کا طریقہ: نظریہ میں ، سی ڈی این اے مختلف لمبائی کے ڈی این اے ٹکڑے ہوتے ہیں ، لہذا الیکٹروفورسس کا نتیجہ سمیر ہوتا ہے۔ اگر آر این اے کی کثرت کم ہے تو ، کوئی بھی پروڈکٹ الیکٹروفورسس میں نہیں دکھائے گی ، لیکن اس کا مطلب یہ نہیں ہے کہ پی سی آر کے ذریعہ کوئی پروڈکٹ بڑھا نہیں جائے گا۔ عام طور پر ، اندرونی حوالہ سی ڈی این اے کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اگر اندرونی حوالہ کے نتائج ہوتے ہیں تو ، سی ڈی این اے کے معیار کی بنیادی طور پر ضمانت دی جاسکتی ہے (کچھ معاملات میں ، اگر ہدف جین کا ٹکڑا بہت لمبا ہے تو ، استثناء بھی ہوسکتے ہیں)۔

2. اگر اس سانچے کے ذریعہ کوئی معروف جین بڑھا ہوا ہے ، تو اس جین کے پرائمر سے اس کی تصدیق کی جا سکتی ہے۔ اندرونی حوالہ کی وسعت کا لازمی طور پر یہ مطلب نہیں ہے کہ سی ڈی این اے کے ساتھ کوئی مسئلہ نہیں ہے۔ چونکہ سی ڈی این اے میں اندرونی حوالہ کی کثرت ہے ، اس کو بڑھانا آسان ہے۔ اگر سی ڈی این اے کو مختلف وجوہات کی بنا پر جزوی طور پر تنزلی کا شکار کیا جاتا ہے تو ، امکانات کے نقطہ نظر سے ، کم کثرت والے ہدف والے جینوں کے پی سی آر نتائج بہت زیادہ متاثر ہوں گے۔ اگرچہ اندرونی حوالہ اب بھی کثرت سے زیادہ ہے ، امپلیفیشن شاید متاثر نہیں ہوگا۔

آر این اے کی جزوی طور پر کمی۔ سالمیت کا پتہ لگائیں اور آر این اے کو پاک کریں۔

مختلف پرجاتیوں کے آر این اے مندرجات مختلف ہو سکتے ہیں ، لیکن عام طور پر ، نکالے گئے کل آر این اے میں جیل الیکٹروفورسس میں دو واضح 28S اور 18S بینڈ شامل ہونے چاہئیں ، اور سابقہ ​​بینڈ کی چمک مؤخر الذکر کے مقابلے میں دوگنی ہونی چاہیے۔ 5S بینڈ اشارہ کرتا ہے کہ آر این اے کو ہراساں کیا گیا ہے ، اور اس کی چمک تنزلی کی ڈگری کے متناسب ہے۔ اندرونی حوالہ کے کامیاب وسعت کا مطلب یہ نہیں ہے کہ آر این اے کے ساتھ کوئی مسئلہ نہیں ہے ، کیونکہ اندرونی حوالہ زیادہ کثرت میں ہے ، آر این اے کو اس وقت تک بڑھایا جا سکتا ہے جب تک انحطاط شدید نہ ہو۔ او ڈی۔₂₆₀/او ڈی₂₈₀سپیکٹرو فوٹومیٹر کے ذریعے ماپنے والے خالص آر این اے کا تناسب 1.9 اور 2.1 کے درمیان ہونا چاہیے۔ آر این اے میں پروٹین کی ناپاکی کی تھوڑی مقدار تناسب کو کم کرے گی۔ جب تک قیمت بہت کم نہیں ہے ، RT متاثر نہیں ہوگا۔ RT کے لیے سب سے اہم چیز RNA سالمیت ہے۔

اندرونی حوالہ جین کی توسیع صرف اس بات کی نشاندہی کر سکتی ہے کہ RT کامیاب ہوا ہے ، لیکن یہ لازمی طور پر سی ڈی این اے اسٹرینڈ کے معیار سے متعلق نہیں ہے۔ چونکہ اندرونی حوالہ جات کے ٹکڑے عام طور پر سائز میں چھوٹے اور اظہار میں زیادہ ہوتے ہیں ، اس لیے ریورس ٹرانسکرپشن میں کامیاب ہونا آسان ہوتا ہے۔ تاہم ، ہدف جین کا سائز اور اظہار جین سے جین میں مختلف ہوتا ہے۔ سی ڈی این اے کے معیار کا اندازہ صرف اندرونی حوالہ سے نہیں لگایا جا سکتا خاص طور پر 2 کلو گرام سے زیادہ کے ہدف کے ٹکڑوں کے لیے۔

کچھ نمونوں میں پیچیدہ ثانوی ڈھانچے ہوتے ہیں ، یا ان میں بھرپور جی سی مواد ہوتا ہے ، یا کم کثرت کے ساتھ قیمتی ہوتے ہیں۔ ان معاملات میں ، ہدف کے ٹکڑے اور نمونے کے سائز کے مطابق مناسب ریورس ٹرانسکرپٹیس کا انتخاب کیا جانا چاہئے۔ اعلی جی سی مواد اور پیچیدہ ثانوی ڈھانچے والے آر این اے ٹیمپلیٹس کے لیے ثانوی ڈھانچے کو کم درجہ حرارت پر یا عام ریورس ٹرانسکرپٹ کے ساتھ کھولنا مشکل ہے۔ ان ٹیمپلیٹس کے لیے ، کوانٹ ریورس ٹرانسکرپٹیس کو منتخب کیا جا سکتا ہے ، کیونکہ اس کی ریورس ٹرانسکرپٹ کی کارکردگی واضح طور پر M-MLV سیریز ریورس ٹرانسکرپٹیس سے بہتر ہے ، جو مختلف آر این اے ٹیمپلیٹس کو مؤثر طریقے سے ریورس کر سکتی ہے اور زیادہ سے زیادہ حد تک آر این اے کو سی ڈی این اے فرسٹ اسٹرینڈ میں ٹرانسکرپٹ کر سکتی ہے۔ عام ریورس ٹرانسکرپٹیس کٹ کا استعمال کرتے وقت ، 20 μl سسٹم صرف 1 μg کل RNA کو مؤثر طریقے سے ریورس کر سکتا ہے۔ براہ کرم کٹ کی زیادہ سے زیادہ RT صلاحیت پر توجہ دیں۔ اگر ٹیمپلیٹ کو اضافی طور پر شامل کیا گیا ہے تو ، ریورس ٹرانسکرپشن زیادہ کثرت کے ساتھ آر این اے کی حمایت کرے گا۔ لہذا ، بہتر ہے کہ نظام کی زیادہ سے زیادہ صلاحیت سے تجاوز نہ کریں۔

A-1 اس بات کا تعین کریں کہ کیا آر این اے شدید طور پر تنزلی کا شکار ہے اور اگر آر ٹی کامیاب ہے۔

عام طور پر ، اندرونی حوالہ بڑھانے کی ناکامی کی وجہ اکثر آر این اے کی سنجیدگی کی وجہ سے ہوتی ہے۔ ایک اور ممکنہ وجہ ریورس نقل کی ناکامی ہے۔ سی ڈی این اے سنگل اسٹرینڈ کے معیار کو جانچنے کے لیے اندرونی حوالہ ایک معیار کے طور پر استعمال نہیں کیا جا سکتا ، لیکن یہ فیصلہ کرنے کے لیے ایک معیار کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے کہ اگر ری این اے کے معیار کا کوئی مسئلہ نہیں ہے تو ریورس ٹرانسکرپشن کامیاب ہے یا نہیں۔ ریورس ٹرانسکرپشن کے عمل میں سب سے اہم بات یہ ہے کہ رد عمل کی کارکردگی کو بہتر بنانے کے لیے مسلسل درجہ حرارت اور مستقل رد عمل کا نظام برقرار رکھا جائے۔

A-2 اس بات کا تعین کریں کہ آیا داخلی حوالہ جین کو بڑھانے کے لیے پرائمر قابل اعتماد ہیں اور اگر پی سی آر میں استعمال ہونے والے ری ایجنٹس کے ساتھ کوئی مسئلہ ہے۔

متعلقہ مقدار کے لیے ، ریورس ٹرانسکرپشن سے پہلے آر این اے کی مقدار لازمی ہونی چاہیے ، جو کہ کئی ریورس ٹرانسکرپشن کٹس میں بھی ضروری ہے ، مثال کے طور پر ، آر این اے ان پٹ کو 1 μg کے طور پر درست کریں۔ چونکہ الٹا نقل شدہ سی ڈی این اے ایک مخلوط حل ہے ، بشمول آر این اے ، اولیگو ڈی ٹی ، انزائم ، ڈی این ٹی پی ، اور یہاں تک کہ تھوڑا سا ڈی این اے کی باقیات ، انحراف کا سبب بنے گا ، لہذا سی ڈی این اے کو درست طریقے سے درست کرنا ناممکن ہے۔ لہذا ، آر این اے کی مقدار ضروری ہے۔ مختلف نمونوں میں ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی کو یکساں سمجھتے ہوئے ، حاصل کردہ سی ڈی این اے کی مقدار ایک جیسی ہونی چاہیے ، اور مقداری تجزیہ کل آر این اے کی ایک ہی مقدار میں مختلف جینوں کے اظہار کی سطح کا موازنہ دکھا سکتا ہے۔ رشتہ دار فلوروسینس مقداری پی سی آر کو انجام دیتے وقت ، ریورس ٹرانسکرپشن کے بعد مقداری سی ڈی این اے کی ضرورت نہیں ہوسکتی ہے کیونکہ اندرونی حوالہ جین کو بطور حوالہ کام کیا جاسکتا ہے۔

یہ بنیادی طور پر جینوں سے متعلق ہے ، اور لمبے ٹکڑے کی ریورس ٹرانسکرپشن زیادہ تر جینوں کے لیے ممکن نہیں ہے۔ سب سے پہلے ، ریورس ٹرانسکرپشن کی کارکردگی پی سی آر کی نسبت بہت کم ہے۔ دوم ، جی سی سے بھرپور علاقہ اور بہت سے جینوں کا ثانوی ڈھانچہ ریورس ٹرانسکرپشن اور پی سی آر دونوں کو محدود کرتا ہے۔ آخر میں ، پی سی آر کی وفاداری اور بڑھاوے کی کارکردگی ایک ہی وقت میں ضمانت دینا مشکل ہے۔ ریورس ٹرانسکرپشن کے عمل میں ، کوئی بھی کم کاپی والے جینوں کے لیے لمبے ٹکڑے حاصل کرنے کی ضمانت نہیں دے سکتا ، خاص طور پر اولیگو ڈی ٹی کا استعمال کرتے ہوئے۔ زیادہ GC کے ساتھ 5 'UTR کے لیے ، یہ اور بھی مشکل ہے۔ لہذا ، یہ اب بھی ایک معقول طریقہ ہے کہ بے ترتیب پرائمر کے ساتھ ٹرانسکرپٹ کو ریورس کریں ، ہدف کے ٹکڑے میں قدرتی درار کی جگہیں تلاش کریں ، طبقات کے ذریعہ بڑھاؤ ، اور پھر پابندی ہضم اور بندش کو انجام دیں۔ عام طور پر ، 2 kb سے بڑے ٹکڑوں کو براہ راست بڑھانا مشکل ہے ، لیکن اسے حاصل کرنا ہمیشہ ناممکن نہیں ہوتا: 1۔ سب سے پہلے ، RNA/mRNA کی سالمیت کی ضمانت ، اور TRIZOL نکالنے کو ترجیح دی جاتی ہے۔ 2. M-MLV RT-PCR کٹ براہ راست استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اینیلنگ کا وقت بڑھاؤ اور پرورش کے عمل میں سائیکل نمبر کو مناسب طریقے سے بڑھاؤ۔ متبادل کے طور پر ، نیسٹڈ پی سی آر کو لاگو کیا جا سکتا ہے ، یا ایک یا دو رد عمل کو پہلے مناسب پی سی آر پرورش سے پہلے مناسب توسیع شدہ ڈینٹریشن اور ایکسٹینشن ٹائم کے ساتھ انجام دیا جاسکتا ہے ، جو ٹکڑوں کو بڑھانے میں مدد دے سکتا ہے۔ پولیمریز کی وفاداری پر توجہ دیں۔ پی سی آر میں مثالی نتائج حاصل کرنے کے لیے لمبی تاک استعمال کی جا سکتی ہے۔ 4. پروٹین ایکسپریشن ایپلی کیشن کے لیے ، اعلی مخلص پولیمریز کا اطلاق ہونا چاہیے۔

TIANGEN کی طرف سے پیش کردہ دو قسم کے ریورس ٹرانسکرپٹ ہیں: کوانٹ/کنگ RTase اور TIANScript M-MLV۔ ان کے درمیان بنیادی فرق ٹیمپلیٹس کی ان پٹ رقم ہے۔ کوانٹ ایک منفرد ریورس ٹرانسکرپٹیس ہے ، جو عام طور پر استعمال ہونے والے M-MLV سے مختلف ہے جو مولونی مورین لیوکیمیا وائرس سے حاصل کیا گیا ہے۔ کوانٹ ایک نئی اعلی کارکردگی والا ریورس ٹرانسکرپٹ ہے جس کا دوبارہ انجینئرنگ ایسچریچیا کولی نے اظہار کیا۔ کوانٹ 50 این جی -2 Rg آر این اے کو زیادہ ریورس ٹرانسکرپشن سرگرمی اور زیادہ پیداوار کے ساتھ بڑھانے کے لیے موزوں ہے۔ عام ایم ایم ایل وی یا اے ایم وی کے مقابلے میں ، کوانٹ کی سب سے بڑی خصوصیت یہ ہے کہ اس کا آر این اے ٹیمپلیٹس کے ساتھ بہت مضبوط تعلق ہے اور وہ ٹرانسکرپٹ پیچیدہ ٹیمپلیٹس کو ہائی ٹمپریچر ڈینٹوریشن کے بغیر ریورس کر سکتا ہے۔ اعلی جی سی مواد والے ٹیمپلیٹس کے لیے ، الٹ کارکردگی زیادہ ہے۔ تاہم ، اس ریورس ٹرانسکرپٹیس میں RNase H سرگرمی ہے ، جو سی ڈی این اے پروڈکٹ کی لمبائی کو متاثر کر سکتی ہے (<4.5 kb ٹیمپلیٹس کے لیے موزوں)۔ روایتی ریورس ٹرانسکرپٹ کے لیے ، TIANScript MMLV ریورس ٹرانسکرپٹ کی سفارش کی جاتی ہے۔ یہ RTase ایک کمزور RNase H سرگرمی کے ساتھ ایک ترمیم شدہ انزائم ہے ، جو طویل (> 5 kb) سی ڈی این اے ترکیب کے لیے موزوں ہے۔

سی ڈی این اے ترکیب اور پرورش کے درمیان ٹیوب کور کو کھولے بغیر ایک ہی ٹیوب میں ایک قدم ریورس ٹرانسکرپشن اور پی سی آر پرورش مکمل کی جاتی ہے ، جو آلودگی کو کم کرنے میں مددگار ہے۔ چونکہ حاصل کردہ تمام سی ڈی این اے نمونے بڑھاوے کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں ، اس لیے حساسیت زیادہ ہوتی ہے ، کم از کم 0.01 پی جی کل آر این اے کے ساتھ۔ کامیاب ایک قدم RTPCR کے لیے ، جین مخصوص پرائمر عام طور پر سی ڈی این اے ترکیب شروع کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ دو قدمی طریقہ ، یعنی ریورس ٹرانسکرپشن اور پی سی آر پرورش دو مراحل میں کی جاتی ہے۔ سب سے پہلے سی ڈی این اے حاصل کرنے کے لیے آر این اے ٹیمپلیٹ سے ریورس ٹرانسکرپٹ کیا جاتا ہے ، اور حاصل شدہ سی ڈی این اے ایک یا زیادہ مختلف پی سی آر رد عمل کا شکار ہوتا ہے۔ دو قدمی طریقہ اولیگو (ڈی ٹی) یا بے ترتیب پرائمر استعمال کرسکتا ہے تاکہ سی ڈی این اے کے پہلے کنارے کی ترکیب کی رہنمائی کرسکے ، اور ایک مخصوص نمونے سے تمام ایم آر این اے معلومات کو نقل کر سکتا ہے۔