TIANSeq NGS لائبریری امپلیفیکیشن ماڈیول۔

اس وقت ، ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ ٹیکنالوجی بنیادی طور پر اگلی نسل کی سیکوینسنگ ٹیکنالوجی پر مبنی ہے۔ چونکہ اگلی نسل کی ترتیب کی ٹیکنالوجی کی پڑھنے کی لمبائی محدود ہے ، ہمیں مکمل لمبائی کی ترتیب کو چھوٹے ٹکڑوں کی لائبریریوں میں ترتیب سے توڑنا ہوگا۔ مختلف تسلسل کے تجربات کی ضروریات کے مطابق ، ہم عام طور پر سنگل اینڈ سیکوینسنگ یا ڈبل ​​اینڈ سیکوینسنگ کا انتخاب کرتے ہیں۔ فی الحال اگلی نسل کی ترتیب لائبریری کے ڈی این اے کے ٹکڑے عام طور پر 200-800 بی پی کی حد میں تقسیم کیے جاتے ہیں۔

a) ڈی این اے ناقص معیار کا ہے اور اس میں روکنے والے ہوتے ہیں۔ اینجائم کی سرگرمی کو روکنے سے بچنے کے لیے اعلی معیار کے ڈی این اے نمونے استعمال کریں۔

ب) ڈی این اے لائبریری کی تعمیر کے لیے پی سی آر فری طریقہ استعمال کرتے وقت ڈی این اے نمونے کی مقدار ناکافی ہے۔ جب ٹکڑے ہوئے ڈی این اے کا ان پٹ 50 این جی سے تجاوز کر جاتا ہے تو ، لائبریری کی تعمیر کے عمل کے دوران پی سی آر سے پاک کام کا بہاؤ انتخابی طور پر کیا جا سکتا ہے۔ اگر لائبریری کی کاپی نمبر براہ راست ترتیب دینے کے لیے بہت کم ہے تو ، ڈی این اے لائبریری کو پی سی آر کے ذریعے اڈاپٹر لیگیشن کے بعد بڑھایا جا سکتا ہے۔

ج) آر این اے آلودگی غلط ڈی این اے کی درست درستگی کا باعث بنتی ہے آر این اے آلودگی جینومک ڈی این اے کی صفائی کے عمل میں موجود ہوسکتی ہے ، جس کی وجہ سے لائبریری کی تعمیر کے دوران ڈی این اے کی غلط مقدار اور ناکافی ڈی این اے لوڈنگ ہوسکتی ہے۔ RNase کو RNase سے علاج کر کے ہٹایا جا سکتا ہے۔

A-1۔

چھوٹے ٹکڑے (60 bp-120 bp) ظاہر ہوتے ہیں Agencourt AMPure XP مقناطیسی موتیوں کے ساتھ طہارت ان اڈاپٹر کے ٹکڑوں کو مؤثر طریقے سے ہٹا سکتی ہے اور تسلسل کے معیار کو یقینی بناتی ہے۔

ب) پی سی آر پرورش کے بعد لائبریری میں بڑے ٹکڑے نمودار ہوتے ہیں اڈاپٹر لگنے کے بعد لائبریری ڈی این اے کے ٹکڑے کا سائز 120 بی پی بڑھ جائے گا۔ اگر اڈاپٹر لیگیشن کے بعد ڈی این اے کا ٹکڑا 120 بی پی سے زیادہ بڑھ جاتا ہے تو ، یہ پی سی آر کی اضافی مقدار کے غیر معمولی ٹکڑے پرور کی وجہ سے ہوسکتا ہے۔ پی سی آر سائیکلوں کی تعداد کو کم کرنا صورتحال کو روک سکتا ہے۔

اڈاپٹر لیگیشن کے بعد لائبریری ڈی این اے کے ٹکڑوں کا غیر معمولی سائز اس کٹ میں اڈاپٹر کی لمبائی 60 بی پی ہے۔ جب ٹکڑے کے دونوں سروں کو اڈاپٹر سے جوڑ دیا جائے تو لمبائی صرف 120 بی پی بڑھ جائے گی۔ جب اس کٹ کے ذریعہ فراہم کردہ کے علاوہ کوئی اڈاپٹر استعمال کریں تو براہ کرم متعلقہ معلومات جیسے اڈاپٹر کی لمبائی فراہم کرنے کے لیے سپلائر سے رابطہ کریں۔ براہ کرم اس بات کو یقینی بنائیں کہ تجرباتی کام کا بہاؤ اور آپریشن دستی میں بیان کردہ مراحل پر عمل کریں۔

ڈی) اڈاپٹر لیگیشن سے پہلے ڈی این اے کا غیر معمولی سائز مختلف ڈی این اے ان پٹ کے لیے مختلف رد عمل کے اوقات استعمال کیے جانے چاہئیں۔ اگر ڈی این اے ان پٹ 10 این جی سے زیادہ ہے تو ، ہم تجویز کرتے ہیں کہ 12 منٹ کا رد عمل کا وقت آپٹمائزیشن کے آغاز کے وقت کے طور پر منتخب کریں ، اور اس وقت پیدا ہونے والے ٹکڑے کا سائز بنیادی طور پر 300-500 بی پی کی حد میں ہے۔ صارفین ڈی این اے کے ٹکڑوں کی لمبائی کو اپنی ضروریات کے مطابق 2-4 منٹ تک بڑھا یا کم کر سکتے ہیں تاکہ مطلوبہ سائز کے ساتھ ڈی این اے کے ٹکڑوں کو بہتر بنایا جا سکے۔

A-2۔

ا) ٹکڑے ہونے کا وقت بہتر نہیں ہے اگر ٹکڑے ٹکڑے شدہ ڈی این اے بہت چھوٹا یا بہت بڑا ہے تو ، براہ کرم رد عمل کے وقت کا تعین کرنے کے لئے ہدایات میں فراہم کردہ فریمگمنٹ ٹائم سلیکشن کے رہنما خطوط سے رجوع کریں ، اور اس ٹائم پوائنٹ کو بطور کنٹرول استعمال کریں ، اس کے علاوہ ایک سیٹ اپ کریں ٹکڑے کرنے کے وقت زیادہ درست ایڈجسٹمنٹ کرنے کے لیے رد عمل کا نظام 3 منٹ کو طول یا مختصر کرنا۔

A-3۔

ٹکڑوں کے علاج کے بعد ڈی این اے کی غیر معمولی سائز کی تقسیم۔

a) فریگمنٹیشن ریجینٹ کا غلط پگھلنے کا طریقہ ، یا ریگینٹ پگھلنے کے بعد مکمل طور پر مکس نہیں ہوتا ہے۔ برف پر 5 × فریگمنٹیشن انزائم مکس ریجنٹ پگھلائیں۔ ایک بار پگھلنے کے بعد ، ٹیوب کے نچلے حصے کو ہلکے سے ریجینٹ کو یکساں طور پر مکس کریں۔ ریجنٹ کو بھنور نہ بنائیں!

ب) ڈی این اے ان پٹ کے نمونے میں EDTA یا دیگر آلودگی شامل ہیں نمک آئنوں کی کمی اور ڈی این اے صاف کرنے کے مرحلے میں چیلاٹنگ ایجنٹ تجربے کی کامیابی کے لیے خاص طور پر اہم ہیں۔ اگر ڈی این اے 1 × TE میں تحلیل ہو جائے تو ، ہدایات میں فراہم کردہ طریقہ استعمال کریں تاکہ ٹکڑے ٹکڑے ہو جائیں۔ اگر حل میں ای ڈی ٹی اے کی حراستی غیر یقینی ہے ، تو یہ سفارش کی جاتی ہے کہ ڈی این اے کو پاک کریں اور اسے بعد کے رد عمل کے لیے ڈیونائزڈ پانی میں تحلیل کریں۔

ج) غلط ابتدائی ڈی این اے کی مقدار ٹکڑے کرنے کے علاج سے پہلے ، رد عمل کے نظام میں ڈی این اے کی صحیح مقدار کا تعین کرنے کے لیے کیوبٹ ، پیکوگرین اور دیگر طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے کی درست مقدار ضروری ہے۔

 د) رد عمل کے نظام کی تیاری ہدایات پر عمل نہیں کرتی ہے بہترین اثر کو یقینی بنانے کے لیے تمام رد عمل کے اجزاء برف پر رکھے جائیں اور رد عمل کے نظام کی تیاری مکمل ٹھنڈک کے بعد کی جائے۔ تیاری مکمل ہونے کے بعد ، براہ کرم اچھی طرح مکس کرنے کے لیے فلک یا پائپیٹ۔ بھنور نہ بنو!

1. اختلاط کا غلط طریقہ (بھنور ، پرتشدد دوڑ ، وغیرہ) لائبریری کے ٹکڑوں کی غیر معمولی تقسیم کا سبب بنے گا (جیسا کہ مندرجہ ذیل تصویر میں دکھایا گیا ہے) ، اس طرح لائبریری کا معیار متاثر ہوگا۔ لہذا ، جب فریگمنٹیشن مکس ری ایکشن سلوشن تیار کرتے ہو تو ، براہ کرم مکس کرنے کے لیے اوپر اور نیچے آہستہ سے پائپیٹ کریں ، یا فنگر ٹپ استعمال کریں اور یکساں طور پر مکس کریں۔ محتاط رہیں کہ بھنور کے ساتھ نہ ملیں۔

2. لائبریری کی تعمیر کے لیے اعلی پاکیزگی کا ڈی این اے استعمال کرنا ضروری ہے۔

DNA اچھی ڈی این اے سالمیت: الیکٹروفورسس بینڈ 30 کلو سے زیادہ ہے ، بغیر ٹیلنگ کے۔

■ OD260/230:> 1.5۔

■ OD260/280: 1.7-1.9۔

3. ڈی این اے ان پٹ کی مقدار درست ہونی چاہیے۔

4. ڈی این اے حل میں ای ڈی ٹی اے کے مواد کا تعین ہونا ضروری ہے ای ڈی ٹی اے کا ٹکڑے ٹکڑے کرنے کے رد عمل پر بہت اثر ہے۔ اگر ای ڈی ٹی اے کا مواد زیادہ ہے تو ، بعد کے ٹیسٹ سے پہلے ڈی این اے صاف کرنے کی ضرورت ہے۔

5. ٹکڑے کرنے کے رد عمل کا حل برف پر تیار ہونا ضروری ہے رد عمل کے وقت کی درستگی کو یقینی بنانے کے لیے ، براہ کرم برف پر رد عمل کا نظام تیار کریں۔

6. ٹکڑے کرنے کے رد عمل کا وقت درست ہونا ضروری ہے

1. اس کٹ پر کس قسم کا نمونہ لاگو ہوتا ہے؟

اس کٹ کا قابل اطلاق نمونہ کل آر این اے یا اچھی آر این اے سالمیت کے ساتھ پاک ایم آر این اے ہو سکتا ہے۔ اگر کل آر این اے لائبریری کی تعمیر کے لیے استعمال کیا جاتا ہے تو پہلے آر آر این اے کو ہٹانے کے لیے آر آر این اے ختم کرنے والی کٹ (بلی#4992363/4992364/4992391) استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

2. کیا FFPE کے نمونے اس کٹ سے لائبریری بنانے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں؟

ایف ایف پی ای نمونوں میں ایم آر این اے کو ایک خاص حد تک کم کیا جائے گا ، نسبتا poor ناقص سالمیت کے ساتھ۔ لائبریری کی تعمیر کے لیے اس کٹ کو استعمال کرتے وقت ، یہ تجویز کیا جاتا ہے کہ وہ ٹکڑے کرنے کے وقت کو بہتر بنائیں (ٹکڑے کرنے کا وقت کم کریں یا تقسیم نہ کریں)۔

3. پروڈکٹ دستی میں فراہم کردہ سائز کے انتخاب کے مرحلے کا استعمال کرتے ہوئے ، داخل کردہ طبقہ میں معمولی انحراف کی کیا وجہ ہوسکتی ہے؟

سائز کا انتخاب اس پروڈکٹ دستی میں سائز کے انتخاب کے مرحلے کے مطابق سختی سے کیا جائے گا۔ اگر کوئی انحراف ہے تو ، اس کی وجہ یہ ہو سکتی ہے کہ مقناطیسی موتیوں کو کمرے کے درجہ حرارت سے متوازن نہیں کیا جاتا ہے یا مکمل طور پر ملا نہیں جاتا ہے ، پائپ درست نہیں ہے یا مائع نوک میں رہتا ہے۔ تجربے کے لیے کم ادسورپشن کے ساتھ تجاویز استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

4. لائبریری کی تعمیر میں اڈاپٹر کا انتخاب۔

لائبریری کی تعمیراتی کٹ میں اڈاپٹر ریجنٹ نہیں ہے ، اور اس کٹ کو TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) کے ساتھ استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

5. لائبریری کا QC۔

کتب خانے کی مقدار کا پتہ لگانا: Qubit اور qPCR کا استعمال بالترتیب بڑے پیمانے پر حراستی اور داڑھ کی حراستی کا تعین کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ آپریشن سختی سے مصنوعات کے دستی کے مطابق ہے۔ لائبریری کی حراستی عام طور پر این جی ایس کی ترتیب کی ضروریات کو پورا کرے گی۔ لائبریری کی تقسیم کی حد کا پتہ لگانا: لائبریری کی تقسیم کی حد کا پتہ لگانے کے لیے Agilent 2100 Bioanalyzer کا استعمال۔

6. پرورش سائیکل نمبر کا انتخاب۔

ہدایات کے مطابق ، پی سی آر سائیکلوں کی تعداد 6-12 ہے ، اور پی سی آر سائیکلوں کی تعداد نمونہ ان پٹ کے مطابق منتخب کی جانی چاہیے۔ اعلی پیداوار والی لائبریریوں میں ، عام طور پر مختلف ڈگریوں میں اضافہ ہوتا ہے ، جو ایجیلنٹ 2100 بائیو اینالائزر کی کھوج میں ٹارگٹ رینج کی چوٹی کے بعد قدرے بڑی چوٹی سے ظاہر ہوتا ہے ، یا کیوبٹ کی کھوج حراستی کیو پی سی آر سے کم ہوتی ہے۔ ہلکا پھلکا ہونا ایک عام رجحان ہے ، جو لائبریری کی ترتیب اور اس کے بعد کے ڈیٹا کے تجزیے کو متاثر نہیں کرتا ہے۔

7. اسپائیکس Agilent 2100 Bioanalyzer کے سراغ پروفائل میں ظاہر ہوتا ہے۔

Agilent 2100 Bioanalyzer detection میں سپائکس کی ظاہری شکل نمونوں کے ناہموار ٹکڑوں کی وجہ سے ہے ، جہاں مخصوص سائز میں زیادہ ٹکڑے ہوں گے ، اور یہ پی سی آر افزودگی کے بعد زیادہ واضح ہو جائے گا۔ اس صورت میں ، یہ تجویز کیا جاتا ہے کہ سائز کا انتخاب نہ کریں ، یعنی 15 منٹ انکیوبیٹڈ کے لیے ٹکڑے ٹکڑے کی حالت 94 ° C پر رکھیں ، جہاں ٹکڑے کی تقسیم چھوٹی اور مرتکز ہے ، اور یکسانیت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔